Чтобы оптимизировать эффективность обнаружения обычного PCR, в дополнение к оптимизации системы реакции и конструкции экстракта, необходимо также обратить внимание на тонкую настройку программы расширения. Вот некоторые ключевые стратегии:

Градиент PCR определяет оптимальную температуру отжига
Температура отжига имеет решающее значение для усиления специфичности. Температуру отжига можно быстро отфильтровать с помощью градиента PCR (например, с градиентом 50°C - 65°C), чтобы избежать неспецифических полос или провала расширения. Если значение Tm экстракта сильно различается, можно попробовать « Touchdown PCR», то есть постепенно снижать температуру отжига с более высокой температуры, отдавая приоритет расширению продуктов высокой специфичности.

2. Оптимизация параметров цикла
- Время преденатурации: для шаблонов с высоким содержанием GC начальная дегенерация может быть увеличена до 5 - 10 минут, обеспечивая цепочку дегенерации ДНК.
- Продолжительность: Корректировка в зависимости от длины расширяющегося фрагмента (обычно 1 кб / мин), но с учетом различий в активности фермента. Например, высокоудерживающие ферменты могут занять больше времени.
- Количество циклов: обычное усиление рекомендуется 25 - 35 циклов. Чрезмерное количество циклов увеличивает риск димера экстракта, который может быть сбалансирован чувствительностью и специфичностью путем разбавления шаблонов или уменьшения числа циклов.

3. Использование добавок
- DMSO или свеклощелочь: смягчает воздействие сложных вторичных структур, особенно для длинных фрагментов или шаблонов с высокой GC (рекомендуемая конечная концентрация 3 - 5%).
Оптимизация концентрации Mg²: Mg² является вспомогательным фактором фермента Taq, концентрация которого (обычно 1,5 - 2,5 мм) должна быть сбалансирована с dNTPs. Оптимальная концентрация может быть определена с помощью экспериментов с градиентом с интервалом 0,5 мм.

4. Качество и количество шаблонов
Избегайте использования шаблонов, содержащих ингибиторы разложения или ингибиторы. Если образец является ДНК окружающей среды, можно добавить этапы предварительной обработки (например, очистка колонны). Количество шаблонов рекомендуется между 1 - 100нг, слишком много может привести к неспецифическому расширению, слишком мало требует увеличения числа циклов.

5. Контрастные настройки
Включает положительный контроль (известный шаблон), отрицательный контроль (без шаблона) и внутренний контроль (например, ген домработницы), чтобы исключить загрязнение реагентом или системные аномалии.