Принципы ELISA

В основе ELISA лежит твердофазирование антигенов или антител и энзимные маркеры антигенов или антител. Антигены или антитела, связываемые на поверхности твердофазного носителя, сохраняют свою иммунологическую активность, а маркированные ферментами антигены или антитела сохраняют как свою иммунологическую активность, так и активность фермента. При измерении исследуемый образец (измеряющий антитела или антигены в нем) реагирует с антигенами или антителами на поверхности твердофазного носителя. Антигенные антитела, образующиеся на твердофазном носителе, отделяются от других веществ в жидкости методом промывки. Антигены или антитела, маркированные ферментами, также соединяются с твердофазными носителями посредством реакции. В этом случае количество ферментов на твердой фазе пропорционально количеству испытуемых веществ в образце. После добавления субстрата ферментативной реакции субстрат катализируется ферментом в цветной продукт, количество которого напрямую связано с количеством испытуемого вещества в образце, поэтому качественный или количественный анализ может быть выполнен в зависимости от глубины цвета. Благодаря высокой каталитической эффективности ферментов косвенно усиливаются результаты иммунных реакций, что приводит к высокой чувствительности методов измерения.

Типы ELISA

ELISA может использоваться для определения антигенов или антител. В этом методе измерения есть три необходимых реагента: (1) твердофазный антимикробный ген или антитела, а именно « иммуносорбент» (immunosorbent); (2) антигены или антитела, маркированные ферментами, называемые « связующими» (conjugate); (3) Фундамент ферментативной реакции. В зависимости от источника и образца реагента, а также конкретных условий обнаружения могут быть разработаны различные типы методов обнаружения. Существует несколько основных типов ELISA для клинических испытаний:

1. Тестирование антигенов методом двойных антителочных заполнителей

Метод с двойным заполнителем антител является широко используемым методом обнаружения антигена Zui, и следующие этапы работы:

1) Специфическое антитело связывается с твердофазным носителем, образуя твердофазное антитело. Стирка удаляет несвязанные антитела и примеси.

2) Плюс проверенный образец, реакция изоляции. Антигены в образцах связываются с твердофазными антителами, образуя твердофазные антигенные антитело - комплексы. Мойка удаляет другие несвязанные вещества.

3) Добавить ферментные маркерные антитела, термоизоляционные реакции. Антигены на твердофазных иммунных комплексах связываются с ферментными антителами. * Вымойте несвязанные ферментные антитела. В это время количество ферментов, содержащихся на твердофазном носителе, связано с количеством исследуемых антигенов в образце.

4) Добавить цвет субстрата. Ферментный каталитический субстрат на твердой фазе становится цветным продуктом. Количество антигенов в образце измеряется с помощью колориметрии.

В клинических испытаниях этот метод применяется для тестирования крупных молекулярных антигенов, таких как различные белки, такие как HBsAg, HBeAg, AFP, HCG и т. Д. При условии получения гетеросексуальных антител к исследуемым антигенам этот метод может быть создан для упаковки твердофазных носителей и подготовки ферментативных соединений. Если источником антител является антисыворотка, антитела, используемые для упаковки и ферментации, взяты у животных разных родов. В случае применения моноклональных антител обычно выбираются два моносопротивления для различных детерминантных кластеров на антигенах, которые используются для упаковки твердофазных носителей и подготовки ферментативных соединений соответственно. Этот метод двухточечного заполнителя имеет высокую специфичность и может изолировать испытуемые образцы вместе с ферментными антителами для последующего обнаружения. При одноступенчатом измерении, когда содержание исследуемых антигенов в образце было высоким, избыточные антигены связывались соответственно с твердофазными антителами и ферментативными маркерными антителами и больше не образовывали « концентрированный комплекс». Аналогично явлению в задней полосе избытка антигена в реакции осаждения, значение поглощения света после реакции (расположенное в зоне избытка антигена) такое же, как и значение поглощения концентрации антигена в стандартной кривой (расположенной в зоне избытка антитела), и, если его измерять обычным методом, полученные результаты будут ниже фактического содержания, явление, известное как эффект крючка (hookeffect), потому что стандартная кривая достигает пика и изгибается крючком. Когда эффект крючка тяжелый, реакция может даже не быть яркой и иметь ложноотрицательный результат. Поэтому при измерении веществ с аномально высоким содержанием в образцах (например, HBsAg, AFP, HCG в сыворотке крови и т.д. Подготовка таких реагентов с использованием моноклональных антител высокой сродства ослабляет эффект крючка. Если в различных точках измеренной молекулы содержится несколько одинаковых детерминантных кластеров, таких как a - детерминантный кластер HBsAg, то одно и то же моносопротивление, определяемое иглой, также может быть упаковано в твердофазные и подготовленные ферментные соединения. Тем не менее, при тестировании HBsAg следует обратить внимание на подтипы, у HBS Ag есть подтипы adr, adw, ayr и ayw4, хотя каждый подтип имеет одинаковую реактивность кластера a - детерминантов, что также является проблемой, на которую следует обратить внимание при использовании моносопротивления в качестве концентрата. Другим важным моментом измерения антигена методом двойного антителоидного заполнителя является интерференция ревматоидного фактора (RF). RF - это аутоантител, в основном тип IgM, который связывается с Fc сегментом IgG у многих животных. Образцы сыворотки, используемые в качестве теста методом двойного антитело - эксцентриситета, если они содержат R F, могут выступать в качестве антигенного компонента и в то же время связываться с твердофазными и ферментными антителами, демонстрируя ложную положительную реакцию. В качестве реагента для ферментативного соединения используются фрагменты F (ab ') или Fab, которые устраняют помехи RF из - за удаления сегмента Fc. Реактор ELISA с двойным сердечником с антителами подвержен воздействию РЧ и включен в качестве оценочного показателя для таких реагентов. Метод с двойным заполнителем антител применяется для определения больших молекулярных антигенов с двумя или более валентными значениями, но не для определения полуантигенов и малых молекулярных моновалентных антигенов, поскольку они не могут образовывать двухбитные заполнители.

2. Определение антител методом двойного антигенного заполнителя

Схема реакции аналогична двойному антитело - центрифугированию. Используйте специфические антигены для упаковки и подготовки ферментативных соединений для обнаружения соответствующих антител. Отличие от косвенного измерения антител заключается в замене ферментного антигена ферментным антигеном. Испытуемые образцы в этом методе не нуждаются в разбавлении и могут использоваться непосредственно для измерения, поэтому их чувствительность относительно выше, чем косвенный метод. Этот метод часто используется для обнаружения анти - HBs в маркерах гепатита В. Ключевым моментом этого метода является подготовка ферментативного антигена, и в зависимости от структуры антигена следует найти подходящий метод маркировки.

3. Косвенное измерение антител

Косвенный метод является распространенным методом обнаружения антител. Принцип заключается в использовании ферментативно маркированных антиантител (антигуманных иммуноглобулинов) для обнаружения проверенных антител, связанных с твердофазными антигенами, и поэтому называется косвенным методом (см. рис. 2 - 3). Этапы работы следующие:

1) Соедините специфический антиген с твердофазным носителем, чтобы сформировать твердофазный антиген. Мойка удаляет несвязанные антигены и примеси.

2) Добавление разбавленной исследуемой сыворотки, реакция изоляции. Специфические антитела в сыворотке связываются с твердофазными антигенами, образуя твердофазные антигенные антитела - комплексы. После стирки на твердофазном носителе остаются только специфические антитела, а другие компоненты сыворотки смываются во время стирки.

3) Добавление ферментативных маркеров антиантител. Для обнаружения общего антитела можно использовать ферментный анти - человеческий Ig, но обычно антитела IgG обнаруживаются с помощью ферментного анти - человеческого IgG. Антитела в твердофазных иммунных комплексах связываются с антителами ферментативного типа, которые косвенно маркируют ферменты. После стирки количество ферментов на твердофазном носителе положительно коррелирует с количеством проверенных антител в образце.

4) Применение данного метода в основном для диагностики инфекционных заболеваний путем обнаружения антител к патогенам.

Преимущество косвенного метода заключается в том, что до тех пор, пока пакет преобразования является антигеном, метод обнаружения соответствующего антитела может быть установлен с использованием одного и того же ферментативного антигена. Ключом к успеху косвенного метода является чистота антигена. Хотя фактические и эффективные результаты иногда могут быть получены с помощью грубого антигенного пакета, он должен быть максимально очищен для повышения специфичности испытания. Особое внимание следует уделять удалению примесей, которые могут вступать в реакцию с сывороткой здорового человека в целом, таких как рекомбинантные антигены, использующие E. Coli в качестве инженерных ферментов, которые, если они содержат компонент E. Coli, вероятно, вступают в реакцию с антителами E. Coli в крови инфицированных E. Coli. Антигены также не могут содержать вещества, которые реагируют с ферментативными маркерами анти - Ig человека, такими как антигены из плазмы крови человека или тканей человека, и ложноположительные реакции также происходят в испытаниях, если Ig из них не удаляется. Кроме того, если антиген содержит несвязанные белки, он также влияет на эффект пакета из - за фактической борьбы за адсорбцию. Другим фактором, влияющим на косвенный метод, является высокая концентрация неспецифических веществ, содержащихся в нормальной сыворотке крови. Специфический IgG, обнаруженный в сыворотке крови пациента, составляет лишь небольшую часть общего IgG. IgG обладает высокой адсорбцией, и неспецифический IgG может быть адсорбирован непосредственно на твердофазный носитель, а иногда и на поверхность, покрытую антигеном. Таким образом, в косвенном методе антигенные пакеты, как правило, повторно завернуты в несвязанные белки (например, белки сыворотки крупного рогатого скота) после того, как они были завернуты, чтобы закрыть свободные промежутки на твердой фазе (блокинг). Кроме того, в процессе тестирования образец должен быть сначала разбавлен (1: 40 ~ 1: 200), чтобы избежать суждения о слишком отрицательном фоновом влиянии результатов.

4. Тестирование на антитела в соответствии с законодательством о конкуренции

Этот метод может использоваться для обнаружения специфических антител, когда интерференционное вещество в антигене нелегко удалить или получить достаточное количество очищенных антигенов. Принцип заключается в том, что антитела в образце и определенное количество ферментных антител конкурируют с твердофазными антигенами. Чем больше антител в образце, тем меньше ферментных антител связывается с твердой фазой, поэтому положительная реакция имеет более светлый цвет, чем отрицательная. Если антиген имеет высокую чистоту, он может быть завернут непосредственно в твердую фазу. Если антиген будет иметь интерференционное вещество, прямой пакет будет нелегко успешно, можно использовать метод захвата пакета, то есть сначала упаковать антитела, соответствующие твердофазному антигену, а затем добавить антиген, чтобы сформировать твердофазный антиген. Мойка удаляет примеси из антигена, а затем добавляет образцы и ферментные антитела для конкурентной реакции. Существуют различные модели определения антител методом конкуренции, которые могут сочетать образцы и ферментные антитела с конкуренцией твердофазных антигенов, и этот метод обычно используется в анти - HBC ELISA. Другая модель состоит в том, чтобы добавить образцы с антигенами в твердофазные антитела для конкурентной комбинации, а затем добавить ферментные антитела после промывки и антигенные реакции, связанные с твердой фазой. Тестирование на HBE обычно проводится с использованием этого метода.

5. Определение антигенов в законодательстве о конкуренции

Малые молекулярные антигены или полуантигены не имеют более двух точек, которые можно было бы использовать в качестве эксцентриситета, поэтому их нельзя измерить с помощью двухантенного эксцентриситета, и они могут быть смоделированы по модели конкурентного права. Принцип заключается в том, что антигены в образцах и определенное количество ферментных антигенов конкурируют с твердыми антителами. Чем больше антигенов содержится в образцах, тем меньше ферментных антигенов связывается с твердой фазой, тем светлее цвет после зуи. Малые молекулярные гормоны, лекарства и другие измерения ELISA используют этот метод.

6. Упаковки для захвата измеряются антителами методом

Тест на антитела IgM используется при ранней диагностике инфекционных заболеваний. Косвенный метод ELISA обычно применяется только для обнаружения общего антитела или антитела IgG. Если антитела IgM были непосредственно измерены косвенным методом антигенной упаковки, то в образцах, как правило, одновременно присутствуют более высокие концентрации антител IgG, которые конкурируют с твердофазными антигенами, в результате чего часть антител IgM не может быть соединена с твердой фазой. Поэтому, если антитело IgM косвенно измеряется с использованием античеловеческого IgM в качестве второго сопротивления, образец должен быть обработан белком A или антителом IgG, чтобы устранить помехи IgG. Для определения IgM - антител в клинических испытаниях используется метод захвата пакетов. Для захвата IgM в образцах сыворотки крови (включая специфические антитела IgM к антигенам и неспецифические IgM) используется античеловеческий пакет антител IgM. Затем добавляется антиген, который сочетается только со специфическим IgM. Затем добавьте ферментативные маркеры специфических антител к антигенам. В свою очередь, при действии субстрата цвет положительно коррелирует с IgM в образце. Этот метод часто используется для ранней диагностики вирусной инфекции. Схема обнаружения антител к вирусу гепатита А (HAV) показана на рисунке 2 - 7. Ревматоидный фактор (RF) также может мешать обнаружению IgM - антител методом захвата, вызывая ложноположительную реакцию. Поэтому в последнее время широко используется косвенный метод нейтрализации IgG, и с помощью таких реагентов были успешно протестированы антитела против CMV IgGM и IgM против токсоплазмы.

7. Закон ABS - ELISA

ABS - это аббревиатура аффинной (avidin) биотиновой (biotin) системы (system). Аффин - это гликопротеин с молекулярной массой 60 000, каждая молекула состоит из четырех субъединиц, которые могут связываться с биотином. Биотины представляют собой небольшие молекулярные соединения с молекулярной массой 244. Химически изготовленные производные - гидроксиянтарные эфиры могут образовывать продукты биомаркеров с различными типами больших и малых молекул, таких как белки и сахара, и метод маркировки довольно прост. Сочетание биотина и аффина имеет сильную специфичность, и его аффинность намного больше, чем реакция антигенных антител, и они чрезвычайно стабильны после их объединения. Поскольку аффин может связываться с четырьмя молекулами биотина, метод ABS и ELISA можно разделить на два типа: ферментный маркер аффин - бион (LAB) и мостиковый аффин - бион (ABC). В обоих случаях ферментные антитела (антигены) в исходной системе ELISA заменяются биомаркированными антителами (или антигенами). В LAB твердофазные биотины сначала реагируют с немаркированными аффинами, а затем добавляют биомаркеры, маркированные ферментами, для дальнейшего повышения чувствительности. На ранних стадиях аффины извлекаются из яичного белка, который является щелочным гликопротеином и имеет сильную адсорбцию с носителем полистирола, который используется в ELISA для увеличения фона. Стрептоксин, полученный из стрептомицина, не имеет этого недостатка и имеет тенденцию заменять первый в применении ELISA. Поскольку ABS - ELISA использует больше двух реагентов, чем обычная ELISA, и добавляет дополнительные этапы работы, ABS - ELISA редко используется в клинических испытаниях.