Иммунодесорбция энзимов (ELISA) - это высокочувствительная технология, широко используемая в исследованиях в области наук о жизни и клинической диагностике. Однако появление ложноположительных результатов в прошлом может ввести в заблуждение научные выводы или клинические суждения. В этой статье подробно анализируются многочисленные причины ложной положительной реакции ELISA и предлагается полный набор стратегий обхода от экспериментального проектирования до анализа результатов, которые помогут вам получить более надежные и точные данные.

Знакомство с ложноположительным: что такое ложноположительный ELISA?
Фальшивый положительный результат ELISA означает, что тест - система ошибочно дает положительный сигнал или результат высокой концентрации, когда целевое вещество фактически отсутствует или имеет очень низкую концентрацию в пробах, подлежащих тестированию. Это не только расточительство ценных образцов и реагентов, но и, скорее всего, приведет к неправильным научным выводам или неправильным медицинским решениям.
Чтобы эффективно избежать ложноположительных реакций, необходимо сначала понять коренные причины их возникновения.

II. Глубокий анализ причин ложноположительных явлений
Причины ложноположительных реакций ELISA сложны и сводятся к трем основным уровням:
1. Реактор и фактор пластины
Кросс - реактивность антител:
Причина: Это одна из наиболее распространенных основных причин. В дополнение к связыванию с особенностями целевого антигена, захват или обнаружение антител могут также иметь неспецифические связи с нецелевыми белками (например, гомогенными белками со сходной структурой, фрагментами разложения белка или другими несвязанными компонентами в образце). Эта перекрестная реакция может непосредственно генерировать сигналы, которые приводят к ложноположительным.
Пример: При обнаружении одного цитокина перекрестные реакции могут возникать, если в образце присутствуют другие цитокины, которые принадлежат к тому же семейству и имеют аналогичную структуру, и антитела недостаточно специфичны.
Неспецифическая адсорбция ферментативных соединений:
Причина: антитела, маркированные ферментами, или связующие вещества, такие как стрептопенициллин, в результате гидрофобного или электростатического воздействия адсорбируются на микропористые стенки или покрытые антитела. Даже без целевого антигена эта адсорбция может привести к каталитическому окрашиванию субстрата.
Недостаточно закрытый или неполный Quan:
Причина: после того, как микропористая пластина была покрыта антитело - пакетом, на пластине все еще было большое количество незанятых участков связывания белка. Закрытые стадии предназначены для заполнения этих участков инертными белками (такими как BSA, обезжиренное молоко и т. Д.), чтобы предотвратить неспецифическую адсорбцию образцов и ферментативных соединений. Неправильный выбор закрытой жидкости, недостаточное время закрытия или отказ закрытой жидкости могут привести к воздействию неспецифических связывающих участков, что приведет к высокому фону и ложному положительному результату.
Загрязнение или разложение реагента:
Причина: субстративный раствор загрязнен ионами металлов или окислителями и может быть самоцветным. Неправильное хранение реагента (например, повторное замораживание и таяние, не избегающее света) приводит к отказу, также может вызвать аномальную реакцию.
2. Факторы выборки
Интерференция гетерофильных антител:
Причина: В образцах сыворотки / плазмы крови человека или животных могут быть антитела, которые могут связываться с Fc или Fab сегментами IgG различных видов, т.е. гетерофильные антитела. Они могут быть похожи на « мосты», соединяющие захватывающие антитела и тестирующие антитела одновременно, и могут формировать полноценную структуру « сэндвича» даже при отсутствии антигена, что приводит к сильным ложным положительным сигналам.
Ревматоидный фактор (RF) помехи:
Причина: ревматоидный фактор является антителом против IgG (в основном IgM), распространенным в образцах пациентов с аутоиммунными заболеваниями. Он может непосредственно связываться с сегментом Fc, который захватывает антитела и идентифицируется последующим добавлением тестовых антител с сегментом IgG Fc, имитируя реакцию антигена - антитела, которая дает ложноположительный результат.
Эффект матрицы выборки:
Причина: Сам образец имеет сложный состав (например, липиды крови, гемоглобин и т. Д.), и его физико - химические свойства могут взаимодействовать с системой ELISA, например, изменять связывающую активность антител или усиливать неспецифическую адсорбцию.
Перекрестное загрязнение:
Причина: В процессе взятия проб аэрозоли или остаточные капли положительного образца или высококонцентрированного стандартного продукта разбрызгиваются в соседние отрицательные отверстия или отверстия низкой концентрации.
3. Факторы эксплуатации и оборудования
Стирать доску без DI:
Причина: Это важнейший шаг, который чаще всего игнорируется. Мойка предназначена для удаления несвязанных образцов белков, ферментных соединений и других мешающих веществ. Если количество стиральных пластин недостаточно, количество жидкости на отверстие недостаточно, время погружения слишком короткое или остаточный скрубберный раствор недостаточно высушен, это может привести к остаткам неспецифического связывающего вещества, вызывая повышение фона и ложноположительный эффект.
Ошибка выборки и загрязнение:
Причина: ошибки или загрязнение могут быть допущены при использовании нескорректированных детонаторов, всасывающих головок с загрязняющими веществами, при распылении жидкости или образовании пузырьков при добавлении проб.
Неправильные условия для инкубации:
Причина: температура инкубации слишком высока или слишком длинна, что может усугубить неспецифические связи. При инкубации не используется уплотнительная пленка или не покрывается должным образом, что приводит к испарению жидкости и повышению концентрации на краю отверстия, создавая « пограничный эффект».
Ошибка интерпретации результатов:
Причина: выходит за рамки линейного обнаружения энзимометром; Слишком длительное время окраски субстрата приводит к насыщению реакцией; При чтении данных была установлена неправильная длина волны или метод вычисления.

Всеобъемлющая стратегия обхода: как снизить ложноположительный до максимума

По этим причинам мы предлагаем следующие системные решения:
Тщательная подготовка перед экспериментом
Выберите качественный набор реагентов: предпочтение отдается маркам с хорошей репутацией, проверенным. Ознакомьтесь с тем, были ли специфические свойства пар антител тщательно проверены и содержат ли они блокирующие средства против гетерофильных антител и RF.
Предварительная обработка образцов: Для образцов сыворотки / плазмы крови эффекты матрицы и мешающие вещества могут быть уменьшены путем центрифугирования, разбавления или использования конкретных агентов предварительной обработки образцов.
Нормативная подготовка реагента: строго следуйте инструкциям по растворению и разбавлению реагента, избегайте повторного замораживания и таяния. Убедитесь, что все реагенты сбалансированы до комнатной температуры перед использованием.
Точные операции в эксперименте
Установить научный контраст:
Пустое отверстие: содержит только субстрат и концевую жидкость для калибровки нулевой точки прибора.
Отрицательный контроль: образец, который явно не содержит целевого антигена, используется для определения фонового уровня сигнала.
Положительный контраст: используется для мониторинга правильной работы всей экспериментальной системы.
Чрезвычайно важно: установить « альтернативный контроль выборки»: в отверстие добавляется только разбавленная жидкость образца без добавления образца, последующие шаги те же. Если в этом отверстии появляется явный сигнал, это убедительно указывает на проблему с самим реагентом или пластиной.
Оптимизация и инкубация:
Используйте откалиброванные детекторы и чистые всасывающие головки, чтобы избежать образования пузырьков.
Строго следуйте рекомендуемому времени и температуре инкубации, при инкубации обязательно используйте уплотнительную пленку.
Адекватная стирка:
Это « жизненный путь» всего эксперимента ELISA. Убедитесь, что трубопровод стиральной машины гладкий, каждое отверстие заполнено стиральной жидкостью.
При ручной промывке пластины, после впрыска промывочного раствора статически в течение 30 - 60 секунд, затем сильно высушить и многократно хлопать по впитывающей бумаге, чтобы убедиться, что в отверстии нет остатков.
Следуйте рекомендуемому в инструкции количеству стирок, не уменьшайте их произвольно.
Тщательный анализ после эксперимента
Разумно установить порог: для качественного тестирования расчет значения Cut - off должен основываться на статистике большого количества отрицательных контрастов и учитывать определенную серую область.
Проверка данных: для критически положительных или необычно высоких значений OD должны проводиться повторные эксперименты. При необходимости образец может быть проверен другим методом (например, Western Blot, химическая люминесценция).
Использование блокаторов: для образцов, подозреваемых в наличии гетерофильных антител или РЧ - интерференций, предварительное высиживание может быть проведено до обнаружения с использованием коммерческого гетерофильного блокатора антител или неимунной сыворотки конкретного вида, которая эффективно нейтрализует помехи.

Фальшивый положительный результат ELISA является многофакторной проблемой, решение которой требует от исследователей систематических теоретических знаний и строгих рабочих привычек. Понимая механизм, лежащий в его основе - от специфичности антител, интерференции образцов до оперативных деталей - и принимая соответствующие профилактические и корректирующие меры, мы можем значительно повысить специфичность и надежность теста ELISA.
Краткое описание основных процессов обхода:
Выберите высококачественный набор реагентов → Стандартная обработка образцов → Создание полного контроля → Точная операция и стирка cherdi → строгий анализ и проверка данных
Следуя этой стратегии, вы сможете максимально использовать технологию ELISA, чтобы сделать ваши научные данные или диагнозы более правдоподобными.