После завершения разделения и культивирования фибробластов из тканей рака пищевода человека требуется дальнейшая идентификация и функциональный анализ клеток, чтобы убедиться, что их биологические характеристики соответствуют экспериментальным требованиям. Следующие ключевые шаги:

1. Клеточные морфологические наблюдения

- Регулярное наблюдение за морфологией клеток с помощью инвертированного микроскопа. Первичные волокнистые клетки обычно имеют форму челнока или многоугольника, растут на стенке, цитоплазма хорошо растягивается. В случае появления круглых плавающих клеток или аномального скопления, которое может указывать на загрязнение или плохое состояние клеток, необходимо пересмотреть условия культивирования.

2. Иммунофлюминесцентная идентификация

- иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью специфических маркеров (например, Vimentin, α - SMA). Фибробласты должны быть высокоэкспрессивными Vimentin, в то время как положительная частота α - SMA может отражать степень их активации. Обратите внимание на то, чтобы установить гомогенные контрасты, чтобы исключить неспецифические связи.

3.Эксперименты по функциональной проверке

- Тестирование на способность к размножению: оценка активности размножения клеток с использованием метода CCK - 8 или EDU для сравнения различий между фибробластами рядом с раком и раковым источником.

- Анализ секреции коллагена: определение уровня секреции коллагена типа I / III с помощью ELISA или Western Blot для определения его фибростимулирующей способности.

- Эксперименты с совместной культурой: фибробласты культивируются вместе с линией раковых клеток пищевода (например, KYSE - 150), чтобы наблюдать их влияние на инвазивную миграцию раковых клеток (например, эксперимент Transwell).

4. Замораживание и восстановление

- Выберите логарифмические клетки фазы роста, распределите их в криогенные трубки с замороженной жидкостью, содержащей 10% DMSO, и после процедурного охлаждения перейдите в жидкий азот. При восстановлении быстрое таяние водяной ванны, центробежное удаление замороженной жидкости, с высокой концентрацией сывороточной питательной среды, повторное подвешивание, через 24 часа замена жидкости.

Меры предосторожности

- Строго стерильные операции, чтобы избежать заражения микоплазмом;

- Периодичность передачи протоклеток рекомендуется не более 5 поколений, чтобы предотвратить поверхностный дрейф;

Функциональные эксперименты должны повторяться более 3 раз для обеспечения достоверности данных.