Рецепты для извлечения и очистки нуклеиновых кислот

Характерные преимущества:

1.Специфичность: все экстракты, используемые в продуктах, проходят тщательный биоинформационный анализ,ГенбанкИ сравнение с собственной обширной базой данных для обеспечения того, чтобы каждый используемый экстракт был генетическим диапазоном, специфичным по роду или типу сыворотки, может обеспечить специфическое обнаружение типа бактерии и типа сыворотки, специфичность достигнутаЦзя А.

2.воспроизводимость: все продукты этой серии были проверены большим количеством экспериментальных штаммов, воспроизводимых какЦзя А.

3.Чувствительность: Продукты этой серии обеспечивают высокую чувствительность к обнаружению бактерий, когда концентрация бактерий в образцах достигает103cfu/млПри этом может быть достигнуто его непосредственное обнаружение, без утомительного процесса размножения бактерий.

4.Полезность: широкий спектр тестов, охватывающих более серьезную опасность для человека17Виды респираторных и кишечных патогенных микроорганизмов, которые могут обеспечить быстрое обнаружение клинических образцов и других проб окружающей среды, весь процесс тестирования3 - 4Один час.

5.преимущество1: Серия богата ресурсами, кромеГенбанкВ дополнение к опубликованным последовательностям компания также провела расшифровку последовательностей большого количества штаммов, чтобы теоретически гарантировать, что выбранный экстракт обладает хорошей консервативностью и специфичностью.

6.преимущество2:: Серия наборов была проверена большим количеством консервативных и специфических экспериментов, и благодаря богатым ресурсам штаммов, которыми обладает компания, каждый тест - набор прошел20Консервативная проверка остальных стандартных и клинических штаммов и40Специфическая проверка остальных близких стандартных и клинических штаммов гарантирует отсутствие ложноположительных и ложноотрицательных результатов при использовании.

РНК и извлечение ДНК:

Расщепление: формула расщепления может быть извлечена из ДНК или РНК различаются, но общим знаменателем является расщепляющийся буфер, содержащий высокую концентрацию ионизирующих солей.

Роль Chaotropes (дегидрат): Chaotrope разрушает взаимодействие между водородными связями и гидрофобией. Изолированные соли включают гуанидин соляной кислоты, гуанидин тиоцианат, мочевину и перхлорат лития.

Моющие средства: В дополнение к дегидрату, в крекинговых буферах обычно есть некоторые дезактиваторы, которые помогают белкам растворяться и расщепляться.

溶июньФерменты и протеаза K: В зависимости от типа образца можно также использовать ферменты для крекинга. Одним из них является протеаза K, которая на самом деле лучше работает в этих дегенеративных буферах; Когда белковая дегенерация увеличивается, действие протеазы K также увеличивается. Однако, растворимыйиюньФерменты не работают в дегенерации, поэтому растворяютсяиюньФерментная обработка обычно проводится до добавления денатурированной соли.

Шаг извлечения:

1. взять образец из отрицательного восьмидесяти холодильников и поместить его на лед для медленного размораживания; (Предварительное охлаждение центрифуги до 4 градусов)

2. После размораживания (красного цвета) добавьте 200 мкл хлороформа (добавьте объем хлороформа 1 / 5 объема тризола), сильное сотрясение (латеритный цвет), статическое пребывание на льду в течение 10 мин. (Хлороформ является органическим растворителем, который эффективно обеспечивает быстрое разделение органической и неорганической фаз. В органической фазе преобладают фенолы и белки, которые отделяют белки от РНК, а РНК попадает в водную фазу.) )

3. Помещение в центрифугу предварительного охлаждения, центрифуга (4 градуса, 12 000 rpm, 15 мин), после центрифуги, очевидно, разделены на три слоя (верхняя бесцветная прозрачная водная фаза для слоя РНК, тонкий молочно - белый в середине для слоя ДНК, нижний слой для слоя белка).

4. Осторожно медленно всасывать верхнюю очистку, около 400 мкл (лучше меньше всасывать, чем больше всасывать), помещен в другую новую трубку Rnase - free EP объемом 1,5 мл, добавить изопропиловый спирт равномерного объема, вверх и вниз перевернутый смешивается, при комнатной температуре при статическом размещении 15 мин.

5. Центрифугирование (4 градуса, 12 000 rpm, 15 мин), видимое осаждение белого цвета (иногда клетки меньше не видят осаждения, можно разместить минус двадцать или минус восемьдесят два часа, прежде чем продолжить последующие шаги)

6. Выбросьте верхнюю очистку, добавьте 950 уль 75% этанола в каждую трубку и перемешайте вверх и вниз вверх и вниз вверх (помните, что не смешивайте хорошо с помощью дутья пистолета, что приводит к растворению РНК).

7. Центрифугирование (4 градуса, 12000 rpm, 10 мин), видимые осадки белого цвета на дне.

8. После центрифугирования сбрасывается верхняя очистка, помещается в центрифугу и снова мгновенно удаляется, остаточная жидкость смывается с помощью 10 - мкл детектора, а открытая крышка высушивается (около 5 мин).

9. Каждый образец добавляет соответствующее количество воды DEPC в зависимости от размера осаждения (обычно 20 - 30 мкл, иногда не видно осаждения, может быть добавлено 10 мкл растворенной воды DEPC), продувание растворенной РНК, концентрация, измеренная энзимометром на одиннадцатом этаже, ODзначение (260 / 280 = 1,8 - 2.0) маркер, минус восемьдесят сохранено.

Примечание: Для извлечения нейтрофиловРНК рекомендует количество клеток больше 2x106 / образцов;

примечаниеНосить маску во время операции.

Конструкция экстракта должна основываться на следующих принципах:
(1) Длина экстракта: 15 - 30bp, обычно около 20bp.
Расширенный пролет экстракта: для 200 - 500bp подходит фрагмент, который при определенных условиях может быть увеличен до 10kb.
(3) Щелочное основание экстракта: содержание G + C 40 - 60% подходит, слишком мало G + C плохо усиливается, слишком много G + C подвержены неспецифическим полосам. ATGC имеет рандомизированное распределение, избегая последовательности из более чем 5 пуриновых или пиримидиновых нуклеотидов.
Избегайте появления вторичной структуры внутри экстракта, избегайте комплементарности между двумя экстрактами, особенно комплементарности на третьем конце, иначе образуется димер экстракта, который создает неспецифические полосы усиления.
Щелочное основание на конце экстракта 3, особенно конечное и предпоследнее, должно быть строго требовательным к спариванию, чтобы избежать провала PCR из - за несовпадения оснований на конце.
В экстрактах есть или могут быть добавлены подходящие участки ферментативного сдвига, а расширенная последовательность мишеней имеет подходящие участки ферментативного сдвига, что полезно для анализа ферментативного сдвига или молекулярного клонирования.
Специфика экстракта: экстракт не должен иметь очевидной гомогенности с другими последовательностями в базе данных нуклеиновых кислот.

Меры предосторожностиА.

1. Экстракция комплекта из холодильной среды должна производиться в течение 15 - 30 минут после равновесия комнатной температуры, и, если после вскрытия пластины пакет фермента не используется, пластина должна храниться в герметичном пакете. Концентрированная моющая жидкость может иметь кристаллическое выделение, разбавление может быть подогрето и растворимо в водяной ванне, промывка не влияет на результат.

2. При каждом шаговом сложении проб должны использоваться аддиторы, точность которых регулярно проверяется во избежание ошибок испытаний. Время одной пробы контролируется в течение 5 минут, и, если количество образцов велико, рекомендуется использовать винтовку плюс образец.

3. Сделайте стандартную кривую одновременно с каждым измерением，Сделайте дубликат отверстия. Если в образце слишком много вещества, подлежащего измерению (образец)Значение OD больше, чем значение OD в стандартном отверстии di), сначала разбавляйте определенное кратное (в n раз) разбавленным раствором образца, а затем измеряйте, при расчете, пожалуйстаещёУмножить на общее разжижение (x N x 5).

4. Пленка уплотнительной пластины предназначена только для одноразового использования во избежание перекрестного загрязнения.

5.Поддоны, пожалуйста, избегайте света для сохранения.

Строго следуя инструкциям, результаты испытаний должны быть основаны на показаниях энзимометра.

Все образцы, моющие средства и различные отходы должны обрабатываться по инфекционным веществам.

8. Компоненты различных партий реагента не должны смешиваться.

9. Нельзя использовать продукты с истекшим сроком годности.

10. В случае расхождения с инструкцией на английском языке преимущественную силу имеет инструкция на английском языке.