Клеточная линия MOC2

Клеточная линия MOC2

Протоколы культуры тканей лаборатории Uppaluri для клеточных линий MOCОбновлено 12.12.16

Необходимые материалы (см. прилагаемый протокол IMDM для реагентов, необходимых для изготовления линии IMDM MOC)

Сигма Олдрих: DMSO: D2650-100ml

FisherScientific:

T150Флашки : 07-200-64

Т75 Флашки : 10-126-37

Криовилы : 03-374-059

Фильтры 45um: 09-754-21

05% Трипсин: sh30236.01

25% Трипсин: sh30042.01

Индолентные линии – MOC1, 22

Агрессивные линии – MOC2

Оттаивающие клеточные линии

1. Добавьте 21 мл линии IMDM MOC в T150 перед отолавлением (или 10 мл в T75, если хотите отолавить в aT75)

2. Удалите криовиал от жидкого азота, флакон распыления с спиртом 70% для очистки его.

3. Держите нижнюю половину криовиала в 37Cwaterbath (не позволяя крышке прикасаться к воде, чтобы избежать загрязнения), пока не останется небольшой кусок льда, который плавает.

4. Опрыскайте криовиал снова с ETOH и поместите в капот. Пипетируйте 1 мл среды в 1 мл клеток и добавьте эти 2 мл в T150, который уже содержит среду (чтобы сделать 22 мл в общей сложности для одного T150).

5. Возьмите некоторые средства уже в колбе T150 и промойте пластину cryovialand это, чтобы убедиться, что у вас есть все остаточные клетки, оставшиеся в криовиале.

Заморожение клеточных линий:

Работать быстро, так как ДМСО токсичен для клеток

Для каждой колбы T150 с 70-80% клеточного сближения заморозить 3-4 флакона.

1. Убор клеток из T150, как видно ниже

2. Спин вниз в пеллету в конусной трубке 15 мл (1000 об/мин х 5 мин)

3. Выброс сверхнагревающего

4. Нажмите коничную трубку 15 мл для суспендирования клеток

5. Добавьте 1,5 мл среды линии IMDM MOC, восстановите клетки в среде - держите на льду

6. Добавьте 1,5 мл замораживающих средств медленно, пока трубка находится на льду

Для производства замораживающих сред – 20% ДМСО в линейных средах IMDM MOC. Например: Для 20 мл запаса - добавьте 16 мл линии IMDM MOC и 4 мл DMSO. Фильтр шприца с использованием фильтра .45um

7. Аликвот 1 мл каждый до 3 криовиалов

8. Храните в -80C не более 2 недель.

9. Поставьте в жидкий азот в течение 1-2 недель.

Примечание: При желании, можно увеличить до 2 мл IMDM и 2 мл замораживающих средств для хранения в 4 флаконах. Кроме того, хорошая идея считать клетки и записывать на флаконе до замораживания клеток.

Клеточная линия MOC2

Характеристики клеточной линии:

Индолент - MOC1: менее агрессивный на основе исследований in vivo. Если проходить 1:12 от 80% слияния T150, требуется 2-4 дня, чтобы достичь 80% слияния. Клеточные линии MOC1 требуют больше времени, чтобы выйти из колбы при сборе урожая, по сравнению с более агрессивными клеточными линиями.

Агрессивный - MOC2: более агрессивный на основе исследований in vivo. Если проходить 1:12 от 80% сближения

T150, требует 2-4 дней, чтобы достичь 80% слияния. Агрессивные клеточные линии выходят из колбы гораздо легче по сравнению с индолентными линиями.

Сбор и передача клеток из T150, 80% сближения:

1. Лийте среду из T150 в сбросную колбу

2. Помыть один раз с 10-20 мл ПБС. Вылить PBS мыть.

3. Добавьте 1,5 мл 0,05% трипсина, наконечную колбу, чтобы убедиться, что трипсин покрывает всю поверхность и, таким образом, касается всех клеток (сделайте это быстро, чтобы клетки не подвергались воздействию трипсина слишком долго), выбросите трипсин, затем повторно примените еще 1,5 мл 0,25% трипсина.

4. Место в инкубаторе 37С. Инкубируйте в течение 3-4 минут для агрессивных клеточных линий и может занять до 10-12 минут для индолентности, но проверьте после 6-8 минут.

5. Нажмите сторону колбы против ладони умышленно несколько раз, чтобы расслабить клетки

6. Проверьте под микроскопом, чтобы увидеть, плавают ли клетки свободно в среде. Если большинство из них нет, разместите в инкубаторе 37С еще 3-5 минут. Постарайтесь не оставлять клетки сидеть в трипсине слишком долго, так как это будет убивать клетки.

7. Как только все или большая часть клеток плавают, добавьте 10 мл линии IMDM MOC для нейтрализации реакции.

8. Пипеттная среда и клетки из колбы в 15 мл конических к клеткам пеллет. Центрифуга при 1000 об/мин х 5 мин.

9. Вылить сверхнатант.

10. Для прохождения клеток в 1:12 - воссуспендировать клетки в еще 12 мл среды.

11. Возьмите 1 мл из этого и поместите в новую колбу T150 с общим объемом 22 мл линии IMDM MOC (разбавление 1:12)

12. Вместите обратно в инкубатор 37С для роста. Достигает 80% слияния через 2-4 дня.

Инъекция в фланг мышей (гетеротопная):

Необходимая концентрация клеток:

MOC1, MOC22: (вводите клетки 1e6 в 0,15 мл) = 6,66e6 клеток/мл MOC2: (вводите клетки 1e5 в 0,15 мл) = 6,66e5 клеток/мл

1. Убор клеток с 0,25% трипсина, как отмечалось выше.

2. После нейтрализации трипсина с помощью линии IMDM MOC среды, спин вниз клетка в гранула (1000 RPM х5 мин) в 50 мл конусной. (Примечание: используйте 50 мл конусного для того, чтобы позволить небольшой гедж иглы нарисовать клетки для

инъекция.

3. Помыть клетки путем ресуспендирования клеточной гранулы в 10 мл холодного ПБС (убедитесь, что удалите как можно больше средств, содержащих ФКС), снова повернуть клетку в гранулу (1000 об/мин х 5 мин)

4. Мойте клетки снова путем ресуспендирования клеточной гранулы в 3-6 мл холодной ПБС (объем определяется размером гранулы, так как вы будете использовать этот объем для подсчета клеток)

5. Считайте cellsperml с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток, используя синий трипан для

Удаление мертвых клеток. Используя общее количество присутствующих клеток (клетки/мл х общее мл ПБС), рассчитайте объем, необходимый для суспендирования клеточной гранулы для достижения концентрации 6,66e6 (MOC1, MOC22) или 6,66e5 клетки/мл (MOC2).

Например, для MOC1 количество клеток составляет: 2,8e6 клеток/мл х 5 мл (PBS) = общая сумма 14e6 клеток. 14e6 клетки / 6,66e6 клетки / мл = 2,1 мл ПБС для суспендирования клеточной гранулы.

6. Спин вниз клетки в гранул снова. Вылить PBS наднатант (без аспирации с помощью пипетты). Ресуспендировать гранулу в рассчитанном объеме холодного ПБС, необходимом для достижения соответствующего

концентрация, имея в виду, что будет ~ 200ul осталось в 50 мл конусной после наливания сверхнатанта.

7. Передайте 50 мл конусного в льду и введите 0,15 мл (150 ул) клеток на мышь в подкожный фланг.

8. Инъекция мышей по стандартному протоколу. Используем шприц 1 мл. Мы изготовляем клетки с помощью 1,5-дюймовой 21-калибровой иглы и переключаем иглу на ½-дюймовую 26-калибровой иглу для введения.

Протокол для медиа 1L